相分离分析方案及技术(Phase Separation)

简介：

相分离是指在细胞液相中，某些蛋白质或核酸可形成无序的高浓度区域(称为波滴或相)，统称为生物分子凝聚物，与经典的膜细胞器相比，生物分子凝聚物更具柔韧性。生物分子凝聚物作为细胞内无膜隔室，以空间和时间控制的方式发生复杂的生化反应。

相关技术及检测方法：

①光激活蛋白Cry2和染料mCherry制备成Cry2olig-mCherry质粒，结合靶基因，进行光漂白检测；

②)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记，共聚焦显微镜检测；
③荧光寿命成像显微镜-福斯特共振能量转移(FLIM-FRET)实验。

[1] Dynamic assembly of the mRNA m6A methyltransferase complex is regulated by METTL3 phase separation(PMiD:35143475)

(一区IF:9.8)

通讯：Kenneth SKosik，美国加利福尼亚州加州大学神经科学研究所，分子、细胞和发育生物学系。

科学问题：

m6A甲基化是mRNA上最丰富和可逆的化学修饰。mRNA m6A甲基转移酶复合物被招募到相分离的核小体中可能对其调节至关重要;然而，其复合物活性受到何种调控目前并不清楚。

实验方法：

本研究先观察到了甲基转移酶复合物的一个核心催化亚单位METTL3内源性地与核小体以及非共定位的点状结构共定位，接下来使用Cry2-METTL3融合构建跟踪复合物组分以解开METTL3相分离所需的关键区域和相互作用。并通过后续实验探究了METTL3如何提供多价性以驱动凝聚，及细胞中的凝聚物组分。

结果及结论：

本研究发现与METTL3和METTL14在扩散相和密集相中的组成型结合不同，WTAP仅与METTL3在密集相中相互作用，从而将METTL3/METTL14单一复合物与METTL3/METTL14多组分凝聚物在扩散相中区分开来。并目，METTL3/METTL14的频聚控制还由其小分子辅因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)确定。因此，SAM结合与复合物相态控制之间的关联表明，其相分离调节对其功能调节至关重要。

[2] Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control(PMID: 29930091)

(一区IF:56.9)

通讯:Richard A Young，麻省理工学院生物系、怀特黑德生物医学研究所

科学问题：

超增强子(SEs)是增强子的聚团，它们协同组装高密度的转录装置，以驱动在细胞特定性方面具有重要作用的基因的强烈表达。本研究为解释调控元件的不同特性建立了一个新的框架，并将相分离调控的生化过程扩展到细胞特性基因调控。

实验方法：

使用CRISPR/Cas9对小鼠胚胎干细胞(mESC)进行工程改造，用mEGFP标记内源性BRD4和MED1，进行ChlP-seg并测量DNA相互作用，测量光漂白后的荧光恢复速率(FRAP)来检查BRD4和MED1是否表现出液体状冷凝物的特征。研究了它们对1，6-己醇的敏感性。用mCherry标记可光激活的自结合Cry2蛋白，不同光刺激检测细胞内无序区域(IDR)依赖性及液滴形成。

结果及结论：
本研究证明了富集于SE的转录共活化因子BRD4和MED1在SE内形成核小体，并表现出波态凝聚体的特性，这些凝聚体被破坏了化学物质干扰凝聚体。BRD4和MED1的IDR可以形成相分离的液滴，MED1-IDR液滴可以从核提取物中进行分隔和浓缩转录。根据这些结果，我们提出了共同激活子IDR在SE中形成相分离凝聚体、分隔和浓缩转录中的作用，并为控制关键细胞特定性基因的机制提供了见解。

[3] interferon-y induces tumor resistance to anti-PD-1immunotherapy by promoting YAP phase separation(PMlD.33606996)

(一区IF:16.0)

通讯：孙书国，华中科技大学同济医学院基础医学院人体解剖学、组织学与胚胎学教研室

科学问题：

干扰素-γ(IFN-γ)介导的适应性耐药是改善实体瘤免疫治疗的主要障碍，但其具体机制仍未阐明。

实验方法：

本研究选用小鼠,肺腺癌的遗传学模型和细胞移植瘤模型，抗PD-1治疗后IFN-γ干扰，结合了免疫荧光、蛋白纯化、体外液滴分析、RT-qPCR、UAS-Luc转录分析、荧光素酶报告分析及HE染色等多项基础实验检测。

结果及结论：

结果显示IFN-γ促进肿瘤细胞中抗PD-1治疗后YAP的核易位和相分离。YAP线圈-线圈结构域的疏水相互作用介导液滴的初始作用，而C端无序区域(IDR)的弱相互作用促进了液滴的形成。YAP与转录因子TEAD4，组蛋白乙酰转移酶EP300和MED1分离，并形成转录中心以**化肥基因转录，独立干经典的STAT1-IRF1转录程序，破坏YAP相分离会抑制肿瘤牛长，增强免疫反应。并使肿瘤细胞对抗PD-1治疗敏感。本研究说明YAP通过其核相分离介导IFN-γ促肿瘤效应，并表明VAP可以作为预测生物标志物和抗PD-1联合治疗的靶点。